Биомиметика эмали — вымысел или будущее стоматологии

Зубная эмаль — это сложная минерализованная ткань, состоящая из длинных и параллельных кристаллов апатита, организованных в перекрещивающиеся эмалевые прутья. В последние годы было предложено множество подходов для создания или регенерации этого высоко привлекательного биоматериала, который характеризуется высокой механической прочностью, относительной устойчивостью и совместимостью с тканями. В данном обзоре мы обсуждаем пять путей к инженерии эмалевой ткани: (i) синтез эмали с использованием физико-химических методов, (ii) рост кристаллов эмали под руководством белковой матрицы, (iii) реминерализация поверхности эмали, (iv) клеточная инженерия эмали и (v) биологическая регенерация эмали на основе индукции морфогенеза зуба de novo.

На данный момент физические методы синтеза с использованием экстремальных условий окружающей среды, таких как pH, температура и давление, привели к образованию кристаллических сборок, похожих на эмаль. Биохимические методы, основанные на белках эмали в качестве матриц, способствовали росту удлиненных кристаллов фосфата кальция. Мы успешно вырастили кристаллы апатита, похожие на эмаль, организованные в перекрещивающиеся эмалевые прутья, используя органическую матрицу белка эмали. Другие исследования, рассмотренные здесь, использовали пептиды, производные амелогенина, или самосборные дендримеры для реминерализации минералозависимых белых поражений на поверхностях зубов.

На данный момент клеточная инженерия эмали сталкивается с ограничениями существующих клеточных линий амелобластов. В будущем эти ограничения могут быть преодолены новыми технологиями клеточной культуры. Наконец, регенерация целого зуба через реактивацию сигнальных путей, активируемых во время естественного развития эмали, представляет собой биологический путь к верной регенерации эмали. В данном обзоре мы обобщили современные достижения в инженерии эмалевой ткани и предоставили новые идеи для будущих возможностей регенерации этой, безусловно, самой увлекательной из всех стоматологических тканей.

Зубная эмаль — это уникальный тканеспецифический биоматериал, характеризующийся исключительными структурными и механическими свойствами, а также эстетической красотой. Уникальные физико-химические свойства эмали обусловлены высоким содержанием гидроксиапатита, параллельным расположением отдельных удлиненных кристаллов апатита в эмалевых призмах и переплетением перпендикулярных призм в трехмерном порядке, напоминающем забор. Эти характеристики делают эмаль материалом с высокой твердостью и физической устойчивостью. Благодаря своей прочности и относительной устойчивости к разрушению, биоматериалы, подобные эмали, имеют большой потенциал в качестве структурных компонентов для будущих биомедицинских и инженерных приложений, включая восстановление эмали зуба, восстановление ортопедических дефектов и использование в качестве функциональных компонентов изоляторов, тормозов и фильтров для выхлопных газов.

Несмотря на желательность регенерации или создания зубной эмали, инженерия эмали de novo и ее потенциальная клиническая реализация остаются сложной задачей. В биологических организмах эмаль образуется только один раз перед прорезыванием зуба, и способность формировать новую эмаль в каждом отдельном зубном органе теряется навсегда, как только зуб полностью прорезан. Высокие концентрации ионов и резкие изменения pH, связанные с начальной амелогенезом, представляют собой серьезное препятствие для клеточных подходов к регенерации зубной эмали. И даже если синтез блоков гидроксиапатита может показаться простым с точки зрения производства, верная фабрикация настоящей эмали с ее параллельно выровненными кристаллами апатита и сложной структурой до сих пор остается трудной задачей. Клетки, лежащие в основе способности природы производить зубную эмаль, называются амелобластами. Амелобласты — это высокоспециализированные эпителиальные клетки, изначально происходящие из эмалевого органа. После дифференцировки из клеток внутреннего эмалевого органа и затем предамелобластов, амелобласты превращаются в высокополяризованные и удлиненные призматические клетки с выраженной эндоплазматической сетью и аппаратом Гольджи, которые синтезируют и секретируют амелогенин и другие белки эмали, а также транспортируют ионы кальция и фосфата в матрицу эмали.

Как только достаточное количество матрицы эмали было синтезировано, амелобласты начинают ресорбировать большие количества воды и деградировавших белков матрицы эмали на стадии ресорбции во время формирования эмали. Хотя логично было бы культивировать амелобласты для in vitro производства зубной эмали, подходы к культуре амелобластов столкнулись с многочисленными трудностями, возможно, из-за высокой степени дифференцировки этих секреторных клеток или из-за отсутствия подходящего тканевого контекста и/или связанных физических сигналов. В сравнении, предшественники амелобластов и клетки промежуточного слоя амелобластов относительно легче поддерживать in vitro, но до сих пор не продемонстрировали никаких доказательств секреции матрицы эмали в культуре. В то же время поддержание постсекреторных амелобластов in vitro остается сложной задачей из-за их сниженной пролиферативной способности. Наконец, клетки из папиллярного слоя и соединительного эпителия потребуют значительного перепрограммирования.

Зубная эмаль — это сложная минерализованная ткань, состоящая из длинных и параллельных кристаллов апатита, организованных в перекрещивающиеся эмалевые прутья. В последние годы было предложено множество подходов для создания или регенерации этого высоко привлекательного биоматериала, который характеризуется высокой механической прочностью, относительной устойчивостью и совместимостью с тканями. В данном обзоре мы обсуждаем пять путей к инженерии эмалевой ткани: (i) синтез эмали с использованием физико-химических методов, (ii) рост кристаллов эмали под руководством белковой матрицы, (iii) реминерализация поверхности эмали, (iv) клеточная инженерия эмали и (v) биологическая регенерация эмали на основе индукции морфогенеза зуба de novo.

На данный момент физические методы синтеза с использованием экстремальных условий окружающей среды, таких как pH, температура и давление, привели к образованию кристаллических сборок, похожих на эмаль. Биохимические методы, основанные на белках эмали в качестве матриц, способствовали росту удлиненных кристаллов фосфата кальция. Мы успешно вырастили кристаллы апатита, похожие на эмаль, организованные в перекрещивающиеся эмалевые прутья, используя органическую матрицу белка эмали. Другие исследования, рассмотренные здесь, использовали пептиды, производные амелогенина, или самосборные дендримеры для реминерализации минералозависимых белых поражений на поверхностях зубов.

На данный момент клеточная инженерия эмали сталкивается с ограничениями существующих клеточных линий амелобластов. В будущем эти ограничения могут быть преодолены новыми технологиями клеточной культуры. Наконец, регенерация целого зуба через реактивацию сигнальных путей, активируемых во время естественного развития эмали, представляет собой биологический путь к верной регенерации эмали. В данном обзоре мы обобщили современные достижения в инженерии эмалевой ткани и предоставили новые идеи для будущих возможностей регенерации этой, безусловно, самой увлекательной из всех стоматологических тканей.

В результате клеточные подходы к регенерации эмали требуют новых стратегий, чтобы достичь уровня мастерства, который является обычным в других моделях клеточной регенерации.

Две недавние конференции, связанные с зубной эмалью (Enamel IX и семинар по разработке «Поощрение новых моделей амелогенеза и экс-виво клеточных линий (ENAMEL)»), обозначили некоторые пробелы в знаниях, которые до сих пор мешают области эмали справляться с вызовами регенерации и инженерии эмали, включая ее бесклеточную природу, высокое содержание минералов и уникальную структурную организацию. Однако за последнее десятилетие несколько лабораторий разработали инновационные подходы для синтеза или инженерии тканей, подобных эмали, или для культуры клеток и тканей, секретирующих эмаль, и таким образом имитировать аспекты развития эмали. Здесь мы обобщили и рассмотрели текущие подходы в качестве руководства для будущих экспериментальных стратегий в области биомиметики эмали и предложили новые концепции, которые, надеемся, будут полезны для будущих усилий по регенерации и инженерии эмали.

В природе преобразование неорганических фосфатов кальция в кристаллические апатиты требует экстремальных условий, таких как высокая температура, высокое давление или необычное pH. Любой синтетический процесс, стремящийся производить гидроксиапатит в качестве основного компонента биосинтетической зубной эмали, должен имитировать биологические условия, необходимые для биоминерализации апатита, и создавать среду, которая напоминает некоторые из экстремальных условий, возникающих во время физиологической кристаллизации гидроксиапатита. Поэтому физические подходы к синтезу эмали зависят от экстремальных условий, таких как температура, давление или изоэлектрическая точка, или их комбинации.

Первое синтетическое поколение нанопрутков апатита основывалось на водном растворе гидроксиапатита, титрованном до pH 2 в сочетании с поверхностно-активным веществом докусат натрия в качестве коллоидного раствора. При корректировке этого раствора до слегка кислых условий (pH 5.8) произошло осаждение кристаллов апатита длиной 200–400 нм с соотношением Ca/P (кальций/фосфат) 1.6, что довольно близко к атомному соотношению Ca/P гидроксиапатита, равному 1.67. Это исследование стало первым успешным подходом к синтетическому получению параллельно выровненных и удлиненных кристаллов апатита, похожих на эмаль.

Для получения нанопрутков апатита, которые более точно соответствуют размеру естественных кристаллов эмали, раствор гидроксиапатита из предыдущего исследования был заменен раствором флюоропатита, а атмосферные условия были изменены для включения интенсивного гидротермального давления путем автоклавирования раствора кристаллизации в течение примерно 10 часов на подложке из железа. Кристаллы флюоропатита, полученные с использованием этого подхода гидротермального давления, имели размеры ~5—10 мкм в поперечнике, что похоже на размер человеческих кристаллов эмали.

Третий синтетический подход был разработан для избежания некоторых экстремальных условий, использованных в предыдущих двух подходах, а именно высокого давления, высокой кислотности и использования токсичных условий нуклеации или эмульгации. Вместо этого этот третий подход основывался на высокой температуре (150–200 °C в течение до 72 часов), буфере бикарбоната натрия для регулирования pH во время формирования кристаллов и растворе кристаллизации, состоящем из тетрагидрата нитрата кальция, ди-натриевого водородфосфата, бикарбоната натрия и октакаальция фосфата при pH 6.6. Полученные в результате этих экспериментов прутки апатита были значительно меньше, чем кристаллы человеческой эмали, и имели размеры от 200 нм до 500 нм в длину и от 100 нм до 200 нм в ширину, а также стехиометрическое соотношение кальция/фосфата до 1.67.

Недавно был разработан трехступенчатый синтетический процесс, имитирующий ключевые аспекты начального формирования эмали, включая (i) конъюгацию карбоксиметилхитозана (CMC) с алендронатом (ALN) для стабилизации аморфного фосфата кальция (ACP) и формирования наночастиц CMC/ACP, (ii) применение гипохлорита натрия (NaClO) для разрушения матрицы CMC-ALN, созданной на первом этапе, и (iii) использование 10 нмоль•л−1 глицина (Gly) для направления наночастиц HAP/ACP (гидроксиапатит/аморфный фосфат кальция) к организации выдерживать жевательные нагрузки на окклюзионных поверхностях во время жевания. Тем не менее, простая задача синтеза материалов, подобных эмали, в блоках откроет будущим стоматологам доступ к высоко биомиметическим материалам, которые могут заменить части эмалевого слоя или весь эмалевый слой при использовании в сочетании с технологиями цифровой обработки и фрезерования.

Эти новые материалы могут значительно улучшить качество стоматологического лечения, обеспечивая не только эстетическую привлекательность, но и функциональные характеристики, близкие к естественной эмали. В результате, такие инновации могут привести к более долговечным и эффективным решениям для восстановления зубов, что, в свою очередь, повысит уровень удовлетворенности пациентов и улучшит общие результаты стоматологического лечения.

Инженерия тканей часто описывается как способ копирования процессов развития для регенеративных целей. Имитирование естественного формирования зубной эмали для целей инженерии тканей включает в себя создание белковой матрицы, богатой амелогенином, и обогащение этой матрицы ионами фосфата кальция. После начального формирования кристаллов апатита этот коктейль подвергается ферментативной обработке с использованием протеаз матрицы эмали, таких как матричная металлопротеаза 20 (MMP20) и калликреин 4 (KLK4), что, предположительно, приводит к первоначальному удлинению кристаллов по оси c, а затем к боковому росту кристаллов по осям a и b. Как оказалось, развитие эмали в природе значительно более сложно, и упрощенный подход, упомянутый выше, пока не был успешен в лаборатории.

Проблемы, с которыми сталкиваются при использовании простого подхода к инженерии эмали, включают имитацию координированного движения амелобластов как формирующих единиц, связанных с секрецией каждой отдельной призмы, динамическую настройку pH раствора минерализации, противодействие ингибирующему воздействию белка амелогенина на рост кристаллов и селективное применение отдельных фрагментов амелогенина в биомиметическом стиле для контроля роста кристаллов апатита. Многомерная симфония событий, которая в конечном итоге приводит к естественной сложности эмали, все еще недостаточно изучена, чтобы предложить универсальную формулу для генерации эмали в лабораторных условиях.

Развитие биологии показало, что начальная матрица эмали состоит на 60–70% из воды, на 20–30% из белков и на 15–20% из минеральных ионов. Три уникальных матричных белка были связаны с развивающейся матрицей эмали: амелогенин, амелобластин и энвелин, которые были названы белками эмали. Среди них амелогенин является наиболее распространенным белковым компонентом в развивающемся слое эмали, составляя более 90% его общего объема. Другие белки, играющие значительную роль в процессе амелогенеза, включают протеазы матрицы эмали, такие как матричная металлопротеаза 20 (MMP20) и калликреин 4 (KLK4), которые способствуют посттрансляционной обработке белков матрицы эмали.
Считается, что белки эмали способствуют трем основным функциям развивающейся матрицы эмали: (i) нуклеации кристаллов гидроксиапатита эмали, (ii) росту кристаллов апатита по оси c и (iii) поддержанию расстояния между отдельными кристаллами апатита во время нуклеации и роста кристаллов. Только после завершения минерализации белки эмали и вода ресорбируются из развивающегося слоя эмали, что приводит к содержанию органических веществ в зрелой эмали всего 1%, в то время как оставшиеся 99% объема составляют неорганические материалы, в основном апатит.

На основе взаимодействия между основными компонентами комбинации белков эмали и растворов для роста фосфата кальция представляют собой логический первый шаг к биологическому синтезу зубной эмали. В поддержку этого подхода нам удалось вырастить удлиненные и параллельные кристаллы апатита внутри перекрещивающихся эмалевых призм, используя матрицу белка эмали. Ранее проведенные исследования с использованием метастабильных растворов октакаальция фосфата в сочетании с 10% (м/об) гелем амелогенина привели к образованию удлиненных кристаллов октакаальция фосфата ограниченной длины и толщины, или кристаллов апатита после добавления фтора. Также было продемонстрировано, что сотрудничество между амелогенином и другим белком эмали, энвелином, привело к стабилизации аморфной фазы кальций-фосфата и увеличению соотношения длины к ширине полученных кристаллов октакаальция фосфата, вероятно, благодаря совместному сбору что представление фрагментов амелогенина и других продуктов расщепления к кристаллам фосфата кальция, нуклеирующим кристаллам, и удлиняющимся поверхностям апатита имеет функциональное значение для правильного роста кристаллов эмали. На данный момент исследования сосредоточены на гидрофильном C-терминале амелогенина, сплайсинговом продукте LRAP (пептид, богатый лейцином), и использовании металлопротеиназы MMP20 для содействия обработке амелогенина. Хотя каждая из этих стратегий улучшила аспекты формирования эмали, будущие исследования еще не смогли уловить каскад событий и взаимодействия между функциями отдельных фрагментов, чтобы имитировать многомерную сложность роста кристаллов эмали млекопитающих.

Недавние исследования подчеркивают близкое расположение гидрофильного C-терминала амелогенина к поверхности растущего кристалла эмали и его роль в содействии росту кристаллов. Функциональная важность C-терминала амелогенина побудила группу исследователей синтезировать олигопептиды, которые структурно напоминали амелогенин, комбинируя гидрофильность C-терминала амелогенина с производным стеариновой кислоты (C18H35COOH) в качестве гидрофобного конца амфифила. Эти амфифилы самоорганизовались, образовав нанофибры шириной 12 нм, и предоставили шаблон для роста аморфного фосфата кальция (ACP) в метастабильном растворе фосфата кальция.

Другой подход сосредоточился на пептиде, богатом лейцином, LRAP, который является фрагментом амелогенина длиной 59 остатков, созданным в процессе альтернативного сплайсинга амелогенина. В этом исследовании были синтезированы две модификации LRAP из свинины: фосфорилированный (+P) LRAP и нефосфорилированный (−P) LRAP, которые были добавлены в раствор, богатый кальцием и фосфатом. Эти пептиды продемонстрировали тенденцию к образованию сферических наночастиц диаметром 10–12 нм и собирались в линейные цепочкообразные структуры. Самособранные пептиды образовали сферические частицы ACP и вызвали фазовый переход ACP в гидроксиапатит (HA), сопровождающийся снижением pH.
Третий подход для определения эффекта продуктов расщепления амелогенина на рост кристаллов эмали включал добавление металлопротеиназы MMP20 в матрицу амелогенина, комбинированную с гелем хитозана и раствором для роста кристаллов фосфата кальция. Эта ситуация несколько напоминала условия in vivo, поскольку предыдущие исследования показали, что мыши, лишенные MMP20, страдали от задержки органической матрицы и низкой кристалличности по сравнению с дикими мышами (WT). Здесь добавление MMP20 способствовало разрушению амелогенина после начального формирования кристаллов, что привело к улучшению биомеханических качеств вновь образованных кристаллов апатита.
На данный момент исследования, использующие биохимический подход, лишь частично имитировали аспекты роста кристаллов апатита и фосфата кальция. Дополнительные улучшения могут привести к созданию биоматериалов, которые более точно будут напоминать естественную эмаль, что затем можно будет применять в стоматологической практике.

После прорезывания зубов клетки и ткани, участвующие в формировании эмали, то есть амелобласты и эмалевый орган, больше не присутствуют на поверхности зуба. Отсутствие естественных средств для регенерации эмали создало возможности для восстановительной стоматологии и замены тканей эмали синтетическими заменителями, такими как амальгама, золото, фарфор и полимерные композиты. Появление биомиметики привело к использованию естественных механизмов, которые либо изменяют механические и химические свойства поверхности эмали, либо позволяют вырастить слои материала, похожего на эмаль, на поверхности уже существующей эмали, используя субстраты, подобные белкам эмали, вместе с растворами для роста апатита.

Польза фторидов для здоровья зубов и их устойчивость к кариесу известны с тех пор, как Фредерик Макай и Грин Вардиан Блэк провели свои groundbreaking исследования о влиянии фторидов на пятнистые и безкариесные зубы, а также исследования фторирования питьевой воды в Гранд-Рапидс, штат Мичиган, Х. Трендли Дином. Фторид влияет на свойства эмали, заменяя гидроксильную группу (-OH) в гидроксиапатите Ca5(PO4)3OH на фторидный ион, образуя либо флюоропатит, либо флюор-гидроксиапатиты. Фторидсодержащий апатит более твердый и менее растворимый по сравнению с апатитом без фторидов, что делает его более устойчивым к кислым средам, что объясняет использование фторидов в зубных пастах и лаках как средства для предотвращения деминерализации, связанной с кариесом. Одним из недостатков избытка фторидов является развитие коричневых и пятнистых зубов (флюороз). Будущие технологии могут привести к разработке альтернатив фториду с меньшими побочными эффектами, которые тем не менее улучшат механические свойства эмали и ее устойчивость к кариесу.

Другие подходы сосредоточены на стратегиях реминерализации эмали с помощью зубных паст. Например, комбинации полноразмерного рекомбинантного свиного амелогенина rP172 и фторидов привели к образованию фторидированного покрытия из фосфата кальция с кристаллическими пучками в форме игл на травмированной поверхности эмали. Исследование in vivo, основанное на желатиновом геле в сочетании с ионами кальция и фторидов для лечения дефектов поверхности эмали, продемонстрировало образование гладкого слоя, похожего на эмаль, но мало что известно о долгосрочных показателях успеха, твердости или структурной целостности вновь образованного слоя эмали.

Третий биомиметический подход к реминерализации поверхности эмали сосредоточен на естественной способности белков эмали нуклеировать и направлять рост кристаллов апатита эмали. Ранее проведенные исследования показали, что полноразмерные белки эмали, такие как амелогенины и энвелин, ингибируют рост кристаллов апатита in vitro. Таким образом, давно предполагалось, что альтернативный сплайсинг и посттрансляционное расщепление белков эмали необходимы для способности матрицы белка эмали способствовать росту кристаллов эмали. Следующие отдельные фрагменты амелогенина были связаны с уникальными функциями, связанными с ростом кристаллов эмали: (i) гидрофобный N-терминал амелогенина, включая его домен TRAP (пептид, богатый тирозином), был связан с самоорганизацией матрицы, (ii) центральная область полипролина предполагалась для контроля расстояния между кристаллами, и (iii) гидрофильный C-терминал продемонстрировал способность облегчать растворимость белка амелогенина и его адгезию к поверхности кристаллов.

В дополнение к этим взаимосвязям между функциональными доменами амелогенина и ростом кристаллов также проявился интерес к двум выдающимся полипептидам в развивающейся матрице эмали извлеченный из свиных зубов и широко используемый для регенерации периодонтальных тканей в клинических условиях. Подтверждая его потенциал для инженерии эмали, EMD образовал структуры, похожие на эмалевые призмы, в сочетании с агарозным гидрогелем на основе хлорида. Соотношение Ca/P полученных минерализованных структур составило 1.69, что близко к значению естественных кристаллов апатита эмали.

В дополнение к натуральным белкам были разработаны синтетические самосборные пептиды, которые служат агентами для содействия реминерализации белых поражений, связанных с начальным кариесом у людей. На данный момент известны три пептида, способствующие реминерализации ранних кариесов/белых поражений: (i) пептид, основанный на повторах амелогенина, состоящий из 22 остатков в пяти тандемных повторах полипролина амелогенина (GLnPro-X) и 7-остаточного гидрофильного хвоста, (ii) тройной повтор аспарагина-серина-серина или 3NSS, основанный на последовательностях повторов аспарагиновой кислоты-серина-серина в фосфопротеине дентин, и (iii) пептид, образующий β-слой, называемый P11-490, который продемонстрировал успех в клинических исследованиях. Кроме того, был создан дендример четвертого поколения (PAMAM-PO3H2) с замечательным сходством с амелогенином в терминах его потенциала к самоорганизации и способности индуцировать реминерализацию кристаллов в направлении оси c in vivo.

В заключение, недавние стратегии достижения регенерации эмали через реминерализацию поверхности показали многообещающие результаты, что предполагает, что дальнейшие исследования, вероятно, улучшат интеграцию вновь синтезированного слоя апатита с уже существующей эмалью и увеличат толщину и механические свойства регенерированной эмали.

Классические подходы к инженерии тканей основываются на сотрудничестве между тканеспецифическими клеточными популяциями, подходящими каркасами и индуктивными факторами, чтобы инициировать каскад событий, ведущий к de novo образованию ткани или органа, утраченного в результате травмы или болезни. Хотя традиционные подходы к инженерии тканей были довольно успешны в нескольких органах, эмаль уникальна тем, что клетки, формирующие эмаль, амелобласты, а также стволовые клетки эмалевого органа теряются в момент прорезывания зуба. Амелобласты — это высокоспециализированные эпителиальные клетки, у которых обратная поляризация располагает ядро на базальном конце, а аппарат Гольджи — на апикальном конце.

Дополнительные трудности в инженерии эмали связаны с тем, что культура клеток амелобластов оказалась сложной. Более того, нуклеация и удлинение кристаллов эмали требуют сложного набора посттрансляционных модификаций белков, в то время как организация кристаллов эмали в призмы и формирование перекрещивающихся узоров призм зависят от высоко координированных движений амелобластов, управляемых механизмами, которые еще предстоит открыть. В результате на данный момент нет сообщений о успешной клеточной инженерии эмали in vivo.

Широко признано, что создание мощной и жизнеспособной клеточной линии амелобластов будет важным шагом к успешной инженерии эмалевой ткани. На данный момент в литературе сообщается о пяти различных клеточных линиях, похожих на амелобласты, а также о различных протоколах для культуры первичных клеток, похожих на амелобласты. Успешная культура первичных клеток эмалевого органа, похоже, зависит от наличия поддерживающего слоя клеток-кормушек, состоящего из фибробластов мыши NIH 3T3, и подходящей трехмерной (3D) среды, такой как каркас из коллагена, чтобы обеспечить основную поддержку или заменить некоторые из эпителиально-мезенхимальных взаимодействий, происходящих во время раннего морфогенеза зуба.

Первичные клетки эмалевого органа, выращенные на слоях клеток-кормушек, как сообщается, экспрессируют амелогенин, амелобластин, MMP20, калликреин 4 и другие белки, связанные с эмалью. В дополнение к протоколам культуры первичных клеток эмалевого органа три из пяти известных клеточных линий, полученных из эмалевого органа, были сообщены как имитирующие качества амелобластов: клеточная линия мыши ALC, клеточная линия дентального эпителия крысы HAT-7 и клеточная линия мыши LS8. Две другие клеточные линии были установлены, но не использовались часто: клеточная линия свиней PABSo-E и клеточная линия крысы SF2-24.

Клеточная линия ALC была первоначально установлена из мышей C57BL/6 J как спонтанно иммортализированная клеточная линия. Эта клеточная линия растет на культуральных пластинах, покрытых коллагеном I, и требует добавления фактора роста эпидермиса (EGF) в среду. Способность клеток ALC экспрессировать амелогенин и туфтелин указывает на их сходство с амелобластами. Недавно эта клеточная линия использовалась для изучения роли транспортёров фосфатов в мембране во время амелогенеза.

Клеточная линия HAT-7 была получена из апикального конца резцов 6-дневных крыс и культивировалась в сочетании с предшественниками цемента BCPb8 и коллагеновым спонжем для создания конструкции, имитирующей эпителиально-мезенхимальные взаимодействия во время раннего морфогенеза зуба. Клетки HAT-7 экспрессировали повышенные уровни амелогенина и амелобластина, что иллюстрирует преимущества внеклеточной матрицы для in vitro амелогенеза. Основываясь на их полярной природе, клетки HAT-7 использовались для отслеживания транспортировки ионов в амелобластах во время формирования эмали. В другом исследовании клетки HAT-7 экспрессировали повышенные уровни амелогенина и амелобластина, что иллюстрирует преимущества внеклеточной матрицы для in vitro амелогенеза. Основываясь на их полярной природе, клетки HAT-7 использовались для отслеживания транспортировки ионов в амелобластах во время формирования эмали. В другом исследовании клетки HAT-7 были использованы для изучения роли гликосфинголипида Gb4 в содействии превращению клеток дентального эпителия в амелобласты. Указывая на их происхождение из эмалевого органа, клетки HAT-7 дифференцировались в клетки, похожие на клетки промежуточного слоя, когда их обрабатывали рекомбинантным человеческим LRAP.

Клеточная линия LS8 является самой старой и наиболее широко используемой клеточной линией для изучения различных аспектов амелогенеза, включая сигнальные пути и динамику цитокинов. Эта клеточная линия была первоначально установлена почти три десятилетия назад путем введения плазмидной конструкции вируса симиан (SV40) в клетки эпителия эмалевого органа. По сравнению с клетками ALC, клетки LS8 демонстрировали более высокие уровни мРНК Amelx, Ambn и Enam, в то время как клетки ALC экспрессировали более высокие уровни мРНК Odam и Klk4. Однако ни одна из этих клеточных линий не была зарегистрирована как формирующая структуры, похожие на эмаль, in vitro, скорее всего, из-за их недифференцированного состояния.

Хотя эти клеточные линии и первичные клетки охватывают различные аспекты амелогенеза и функции амелобластов, ни одна из них не напоминает многофункциональные производные эмалевого органа, ответственные за формирование эмали во время развития зуба. Это может быть связано с происхождением, стадией развития и уровнем дифференцировки выбранных клеток или вызвано отсутствием контекста окружающей среды, как в отношении внеклеточной матрицы, так и соседней ткани. Иммортализованные амелобласты, по сути, будут лишены соседнего слоя стволовых клеток промежуточного слоя, в то время как иммортализованные линии, основанные на промежуточном слое и звездчатой ретикулярной ткани, не имеют уровня дифференцировки, необходимого для секреции белков эмали. Более того, иммортализация связана с значительной степенью дедифференцировки, что препятствует амелобластам поддерживать уровень дифференцировки, необходимый для секреции амелогенинов и других белков эмали. В результате были исследованы другие источники стволовых клеток амелобластов, включая стволовые клетки шейного петли, остатки эпителия Малахеза (ERM), индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC) и кератиноциты. Комбинации одонтогенных стволовых клеток вместе с подходящими каркасами и подобранными комбинациями факторов роста, вероятно, приведут к образованию эпителиально-мезенхимальных интерфейсов, подходящих для долгосрочной культуры, и будут способствовать поддержанию стабильных клеточных линий, похожих на амелобласты, для целей инженерии эмалевой ткани.

Предыдущие четыре главы сосредоточились на отдельных подходах к инженерии эмалевой ткани, будь то через физический синтез, биохимическую инженерию, реминерализацию поверхности эмали или культуру клеток эмалевого органа. Однако регенерация целого зуба представляет собой более сложную задачу, требующую интеграции всех этих подходов и более глубокого понимания биологических процессов, происходящих во время развития зуба.

Регенерация целого зуба включает в себя восстановление не только эмали, но и других тканей, таких как дентин, пульпа и периодонт. Это требует создания многоуровневой структуры, которая может воспроизводить сложные взаимодействия между различными клеточными типами и матрицами, которые происходят в естественном процессе формирования зуба.

Одним из ключевых аспектов успешной регенерации целого зуба является восстановление сигнальных путей, которые активируются во время естественного развития зуба. Эти сигнальные пути регулируют дифференцировку клеток, их миграцию и взаимодействие, что критически важно для формирования правильной архитектуры зуба.

Современные исследования в области регенерации целого зуба также исследуют использование стволовых клеток, которые могут дифференцироваться в различные типы клеток, необходимые для формирования зубных тканей. Например, стволовые клетки, полученные из зубных зачатков, шейной петли или других источников, могут быть использованы для создания клеточных конструкций, которые затем могут быть интегрированы в организм.

Кроме того, использование биоматериалов, которые могут служить каркасами для роста клеток и поддерживать необходимые механические и химические свойства, также является важным направлением в исследованиях. Эти материалы должны быть биосовместимыми и способствовать взаимодействию с окружающими тканями.

В заключение, подход к регенерации целого зуба требует комплексного подхода, который объединяет знания из различных областей, включая биологию, материаловедение и инженерные науки. Успех в этой области может привести к значительным достижениям в стоматологии, позволяя восстанавливать утраченные зубы и улучшать качество жизни пациентов.

Материалы, созданные с использованием подходов к регенерации, могут найти применение в различных областях, включая восстановление зубов и другие биомедицинские приложения.

Физический синтез, биохимическое шаблонирование и контроль роста кристаллов эмали, а также реминерализация поверхности или использование листов клеток, похожих на амелобласты, для секреции белков эмали и помощи в превращении ионов кальция и фосфата в кристаллы апатита, представляют собой различные подходы к инженерии эмали. Каждый из этих подходов имеет свои концептуальные преимущества, но синтез их сильных сторон в рамках подхода регенеративной медицины имеет наибольшую вероятность верно регенерировать «настоящую» эмаль с ее высоко направленными и параллельными кристаллами апатита и перекрещивающимися пучками эмалевых призм.

Однако непосредственным недостатком такого подхода является отсутствие тканей с регенеративной способностью формировать эмаль сразу после прорезывания зуба. В результате успех регенеративных подходов к созданию эмали de novo тесно связан с возможностью успешной регенерации целых зубных органов.

Регенерация целых зубных органов долгое время считалась высшей целью стоматологической регенеративной медицины. Во время начального развития зуба эпителиальные и мезенхимальные ткани взаимодействуют, формируя зачатки зубных органов, которые продолжают развиваться и дифференцироваться в одонтогенные ткани, включая амелобласты, одонтобласты и клетки шейной петли. С концептуальной точки зрения, имитация этих сигнальных каскадов для индукции формирования зуба de novo на менее дифференцированном эпителиально-мезенхимальном интерфейсе представляется логичным следующим шагом. Однако прогрессия интерфейсов эпителиально-мезенхимальных зачатков в полностью дифференцированные зубы требует уникальных структурных и индуктивных условий.

Одним из примеров успешного восстановления целого зуба является недавняя трансплантация биоразработанных зубных зачатков в модель донора. Однако этот подход зависит от использования реинституированных клеток зубного зачатка собаки. Способность зубных органов на стадии капли формировать полностью дифференцированные минерализованные ткани дентин и эмаль при экстракции на культуральные чашки Троуэлла известна на протяжении десятилетий. Эта модель культуры Троуэлла представляет собой жизнеспособную модель для роста тонких слоев полностью развитой призматической эмали in vitro. Зубные органы на стадии капли также могут быть трансплантированы в капсулу почки или в переднюю камеру глаза, что приводит к дальнейшим стадиям осаждения эмали.

С быстрым развитием технологий трехмерной клеточной культуры применение специфических факторов амелобластов для дальнейшего роста и дифференцировки тканей, похожих на эмаль, будет использовать естественную способность эмалевого органа производить призматическую эмаль с механическими свойствами, аналогичными человеческой эмали. Кроме того, подготовка биомиметической эмали, выращенной в биореакторах с использованием технологий компьютерного проектирования и производства, может развиться в материалы для ремонта эмали при кариесе.

С клинической точки зрения неясно, станут ли синтетическая или регенерированная эмаль когда-либо основным биотехнологическим продуктом, используемым в будущих стоматологических кабинетах. Скорее, материалы, похожие на эмаль, созданные с использованием этих подходов, могут найти применение в различных областях стоматологии и медицины.

Биоматериалы, вероятно, найдут применение во многих других биомедицинских или инженерных приложениях благодаря своей огромной прочности, устойчивости и биосовместимости. С развитием регенеративных процедур вполне возможно, что подходы к регенерации целых зубов в один прекрасный день будут применены для решения проблемы ремонта или замены пораженных или утраченных зубных тканей.

Ряд генов и путей был связан с регуляцией числа зубов и их развития, включая сигналы Sprouty/фактор роста фибробластов (FGF), ген Ectodysplasin A (EDA) и его мишени Dickkopf 4 (DKK4)/Wingless (Wnt), а также другие члены семейства Wnt/β-катенин, а также дисбалансы в гомеостазе WNT/Sonic hedgehog (SHH). Продукты генов, связанные с суперномерарными зубами, могут быть применены в сочетании с подходящими системами доставки для индукции формирования зубов de novo в областях вне зубной дуги, и эти суперномерарные зубы могут быть затем автотрансплантированы для замены утраченных или пораженных зубов.

На сегодняшний день инженерия эмали остается уникальной биотехнологической задачей. Прогресс в биоинженерии эмали ограничен частично из-за высокого уровня специализации и взаимосвязанности клеток, участвующих в осаждении эмали, а также из-за высокоразвитых свойств материалов биологической эмали. Подходы к синтезу de novo выиграют от дальнейшего понимания физико-химических условий, необходимых для верного синтеза кристаллов апатита, и роботизированного осаждения слоев, чтобы имитировать призматическую организацию биологической эмали.

Биохимические подходы к регенерации эмали могут использовать новые технологии 3D-биопечати и сочетать упорядоченное осаждение матрицы/минералов с этапами ферментативного разрушения матрицы. Подходы к поверхностной биоминерализации улучшатся с развитием дизайна пептидов и технологий дендримеров. Инновации в технологии биореакторов предназначены для расшифровки оптимальных условий и среды, необходимых для культур клеток эмалевого органа и амелобластов. Наконец, прогресс в техниках инженерии целых органов в сочетании с новыми знаниями о индукции зубов и сигнальных каскадах поддержания обеспечит надежные подходы для будущей органогенезы зубов de novo.

Вместе пять путей инженерии зубной эмали, описанные здесь, приведут к множеству новых технологий, которые не только создадут новые биоматериалы и биотехнологии для регенеративной медицины, но и помогут глубже понять уникальные биологические механизмы, способствующие образованию этой самой уникальной биологической ткани: зубной эмали.